高度靶向的CRISPR递送推进了活体动物的基因编辑

如今，大多数获批的基因疗法，包括涉及CRISPR-Cas9的基因疗法，都会对从体内取出的细胞发挥魔力，然后将编辑后的细胞返回给患者。

该技术是靶向血细胞的理想选择，目前是新批准的用于治疗镰状细胞性贫血等血液疾病的CRISPR基因疗法的方法，其中编辑后的血细胞在患者的骨髓被化疗破坏后重新输注。

1月11日发表在 《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上的一种新的CRISPR-Cas9精确靶向递送方法，可以在体内对非常特定的细胞亚群进行基因编辑，这是朝着可编程递送方法迈出的一步，该方法将消除在给予患者编辑血细胞之前抹去骨髓和免疫系统的需要。

这种递送方法由加州大学伯克利分校（University of California， Berkeley）的实验室开发，Jennifer Doudna是CRISPR-Cas9基因组编辑的共同发明者，涉及将Cas9编辑蛋白和引导RNA包裹在膜泡中，膜泡上装饰有单克隆抗体片段，这些单克隆抗体片段位于特定类型的血细胞上。

作为演示，创新基因组学研究所（IGI）Doudna实验室的CRISPR研究员Jennifer Hamilton靶向免疫系统的一个细胞 – T细胞 – 这是称为嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的革命性癌症治疗的起点。汉密尔顿和她的同事们治疗了配备人源化免疫系统的活小鼠，并将其人类T细胞转化为CAR T细胞，能够容纳并消除另一类免疫细胞，即B细胞。

汉密尔顿说，这一壮举证明了原理，显示了使用这种载体方法（包膜递送载体）靶向和编辑血细胞以及活体动物（体内）以及最终人类中可能的其他类型的细胞的潜力。

“我们的方法涉及多重靶向分子，也就是说，在我们的粒子上有两个或多个靶向分子，它们与靶细胞相互作用，有点像计算机中的AND门，”汉密尔顿说，指的是仅在两个事件同时发生时才运行的逻辑电路。“当颗粒使用两种抗体配体相互作用结合时，我们能够获得更有效的递送。在用T细胞靶向载体处理小鼠后，我们在感兴趣的细胞类型T细胞中观察到基因组工程，而不是在肝细胞中。

她说，对于所有将基因递送到细胞中的方法来说，高度特异性的靶向都是困难的。尤其是肝细胞，经常占用指向其他地方的输送工具。

病毒包膜

汉密尔顿和她的团队正在研究几种提供基因疗法的实验技术之一。许多病毒采用封装病毒的外层——病毒被清空并塞满纠正性转基因或基因编辑工具，如CRISPR-Cas9。其他方法，包括IGI研究人员正在探索的方法，依赖于直接将细胞穿透性Cas9蛋白注射到小鼠体内以实现基因组编辑。

珍妮·汉密尔顿，IGI/加州大学伯克利分校

汉密尔顿在攻读博士学位时研究了流感等包膜病毒，她专注于设计这类病毒，因为它们具有更灵活的外层，由它们萌芽的细胞的外膜组成。

在 2021 年的一篇出版物中，她证明了 HIV-1 病毒的外部包膜已被内脏并充满 Cas9，她称之为病毒样颗粒 （VLP），可以在培养物（离体）中编辑 T 细胞并将其转化为 CAR T 细胞。从那时起，她对病毒信封进行了如此多的改变，以至于她现在将它们称为信封的送货工具或EDV。

EDV的一个关键方面是它们的外膜可以很容易地用多个抗体片段或靶向配体装饰，这大大提高了靶向特异性。其他基因递送载体，如腺相关病毒和脂质纳米颗粒，已被证明更难精确靶向。

“正在努力重新靶向所有这些载体，使其对一种细胞类型具有特异性，并将它们去靶向其他细胞类型，”汉密尔顿说。“你可以展示抗体或抗体片段，就像我们一直在做的那样，但旁观者细胞的摄取率仍然很高。您可以将递送偏向到一种细胞类型，但您仍可能观察到旁观者细胞的摄取。在我们的论文中，我们实际上查看了肝脏，看看我们是否得到了脱靶的递送，但没有看到任何结果。我认为使用更传统的无包膜病毒载体或脂质纳米颗粒实现这一目标将更具挑战性。

在这篇论文中，汉密尔顿和她的同事试图 在体内 复制一种 体外 CRISPR CAR T细胞疗法，该疗法于2020年在 《科学》 杂志上报道。这种疗法不仅为靶向癌细胞的受体提供了转基因，而且使用CRISPR敲除了不靶向癌症的受体。

加州大学伯克利分校的研究人员成功地敲除了天然T细胞受体，并为靶向B细胞的受体（癌细胞的代理）提供了转基因。由于 Cas9 蛋白与转基因一起在同一 EDV 中递送，因此与递送 Cas9 基因的方法相比，它的寿命更短，这意味着更少的脱靶编辑。

“我们在这篇论文中试图实现的目标，”汉密尔顿说，“是跳过必须在体外设计细胞的整个步骤。我们的目标是系统地施用一种单一载体，该载体可以在体内的特定细胞类型中同时进行基因递送和基因敲除。我们使用这种递送策略在 体内制造基因编辑的CAR T细胞，希望我们能够简化用于 在体外制造基因编辑CAR T细胞的复杂过程。

Connor Tsuchida/加州大学伯克利分校

Doudna和她的实验室继续提高EDV介导的输送效率。汉密尔顿曾是杜德纳实验室的博士后研究员，作为IGI女性进取科学项目的研究员，他正在进一步开发这种交付方法。该实验室专注于 在体内 起作用的载体的最终原因是使CRISPR疗法更广泛地可用，更便宜。在最近发表在《连线》杂志上的一篇文章中，杜德纳提到了当今昂贵的基因疗法的不公平性，部分原因是患者接受骨髓移植时需要延长住院时间。

“镰状细胞病的治疗预计每位患者的成本将超过200万美元，而美国只有少数机构具有提供这种治疗的技术能力，”Doudna写道，她因共同发明CRISPR-Cas9基因组编辑而获得2020年诺贝尔化学奖。“允许 体内 递送基因编辑疗法和改进制造的新技术将是降低价格的关键，大学、政府和行业之间的独特伙伴关系也将与可负担性结合在一起，作为共同目标。仅仅制造工具是不够的。我们必须确保它们到达最需要它们的人手中。

除了Hamilton和Doudna之外，该论文的其他合著者还有Evelyn Chen，Barbara Perez，Cindy Sandoval Espinoza，Min Hyung Kang和Marena Trinidad，他们都隶属于IGI和加州大学伯克利分校的分子和细胞生物学系，以及旧金山格莱斯顿研究所的Wayne Ngo。

资金由美国国立卫生研究院（RM1HG009490，U01AI142817-02，U19 64542,64340），美国能源部（63645），Emerson Collective和霍华德休斯医学研究所提供。汉密尔顿得到了美国国家普通医学科学研究所 （K99GM143461-01A1） 和 Jane Coffin Childs 医学研究纪念基金的支持。

相关信息

• 使用包封递送载体的体内人 T 细胞工程 （Nature Biotechnology）
• CRISPR-Cas9 和转基因的靶向递送可实现复杂的免疫细胞工程（Cell Reports，2021 年）
• 你如何进入牢房？复制病毒 （2021）
• 创新基因组学研究所
• Doudna lab’s 网站