鸟类中的垃圾DNA可能是安全、有效基因治疗的关键

最近批准的CRISPR-Cas9疗法用于治疗镰状细胞病表明，基因编辑工具可以出色地敲除基因以治愈遗传性疾病。但是，仍然不可能将整个基因插入人类基因组中以替代有缺陷或有害的基因。

一种利用鸟类逆转录转座子将基因插入基因组的新技术在基因治疗中更有希望，因为它将基因插入人类基因组中的“安全港”，插入不会破坏基本基因或导致癌症。

逆转录转座子或逆转录元件是DNA片段，当转录为RNA时，会编码将RNA复制回基因组中DNA的酶 – 这是一个自私的循环，使基因组与逆转录转座子DNA混淆。大约40%的人类基因组是由这种“自私”的新DNA组成的，尽管大多数基因都被禁用了，即所谓的垃圾DNA。

这项新技术被称为精确RNA介导的转基因检测（PRINT），它利用一些逆转录转座子的能力，在不影响其他基因组功能的情况下有效地将整个基因插入基因组中。PRINT将补充CRISPR-Cas技术公认的禁用基因、进行点突变和插入DNA短片段的能力。

加州大学伯克利分校分子和细胞生物学教授凯瑟琳·柯林斯（Kathleen Collins）实验室开发的PRINT描述将于2月20日发表在 《自然生物技术》杂志上。

PRINT涉及使用类似于将CRISPR-Cas9运送到细胞中进行基因组编辑的递送方法将新DNA插入细胞中。对于PRINT，一段递送的RNA编码一种称为R2蛋白的常见逆转录元件蛋白，该蛋白具有多个活性部分，包括切口酶（一种结合和切口双链DNA的酶）和逆转录酶（产生RNA的DNA拷贝的酶）。Collins说，另一个RNA是要插入的转基因DNA的模板，加上基因表达控制元件 – R2蛋白插入基因组的整个自主转基因盒。

使用 R2 蛋白的一个关键优势是，它将转基因插入基因组的一个区域，该区域包含数百个相同基因的相同拷贝——每个拷贝都编码核糖体 RNA，核糖体 RNA 是将信使 RNA （mRNA） 翻译成蛋白质的 RNA 机器。有了如此多的冗余拷贝，当插入破坏一个或几个核糖体RNA基因时，基因的丢失不会被遗漏。

将转基因放入安全港可以避免通过人类病毒载体插入转基因时遇到的一个主要问题，这是当今常见的方法：基因通常被随机插入基因组中，使工作基因失效或扰乱基因的调控或功能，可能导致癌症。

“基于CRISPR-Cas9的方法可以修复突变核苷酸或插入一小块DNA——序列修复。或者你可以通过位点特异性诱变来敲除基因功能，“柯林斯说，他担任沃尔特和露丝舒伯特家族主席。“我们不是在敲除基因功能。我们不是在修复内源性基因突变。我们正在采取一种互补的方法，即将一个自主表达的基因放入基因组中，该基因可以产生活性蛋白质 – 将功能基因添加回去作为缺陷旁路。这是转基因补充而不是突变逆转。为了解决由同一基因的一系列个体突变引起的功能丧失疾病，这很棒。

“真正的赢家来自鸟类”

许多遗传性疾病，如囊性纤维化和某些形式的血友病，都是由同一基因中的许多不同突变引起的，所有这些都使基因的功能失效。任何基于CRISPR-Cas9的基因编辑疗法都必须针对一个人的特定突变进行定制。使用PRINT的基因补充可以将正确的基因传递给每个患有这种疾病的人，使每个患者的身体都能产生正常的蛋白质，无论原始突变是什么。

Briana Van Treeck，加州大学伯克利分校

许多学术实验室和初创公司正在研究使用转座子和逆转录转座子插入基因治疗的基因。生物技术公司正在研究的一种流行的逆转录转座子是LINE-1（长分散元素-1），它在人类中已经复制了自身和一些搭便车的基因，覆盖了大约30%的基因组，尽管我们基因组的LINE-1逆转录转座子拷贝中只有不到100个是有效的，只是基因组的一小部分。

12月14日，柯林斯与加州大学伯克利分校的博士后同事Akanksha Thawani和加州大学伯克利分校分子和细胞生物学系杰出教授、霍华德休斯医学研究所研究员Eva Nogales一起在 《自然》杂志上发表了由LINE-1逆转录元件编码的酶蛋白的冷冻电子显微镜结构。

柯林斯说，这项研究清楚地表明，LINE-1逆转录转座子蛋白很难设计，无法安全有效地将转基因插入人类基因组中。但先前的研究表明，插入基因组重复核糖体RNA编码区域（rDNA）的基因得到正常表达，柯林斯认为，一种称为R2的不同逆转录元件可能更适合安全的转基因插入。

由于R2在人类中没有发现，来自加州大学伯克利分校的Collins和高级研究员Xiaozhu Zhang和博士后研究员Briana Van Treeck从昆虫到马蹄蟹和其他多细胞真核生物的数十个动物基因组中筛选了R2，以找到一种高度靶向人类基因组中rDNA区域的版本，并有效地将长DNA插入该区域。

“在追逐了几十只之后，真正的赢家来自鸟类，”柯林斯说，包括斑胸雀和白喉麻雀。

虽然哺乳动物的基因组中没有R2，但它们确实具有R2作为逆转录元件有效插入所需的结合位点 – 她说，这可能是一个迹象，哺乳动物的前辈有一个类似R2的逆转录元件，不知何故被踢出了哺乳动物基因组。

在实验中，Zhang和Van Treeck合成了编码mRNA的R2蛋白和模板RNA，该模板RNA将产生由RNA聚合酶启动子表达的荧光蛋白的转基因。这些细胞被共转染到培养的人类细胞中。由于荧光蛋白在激光下的表达，大约一半的细胞呈绿色或红色亮起，这表明R2系统已成功将表达荧光蛋白的基因插入基因组中。

进一步的研究表明，转基因确实插入了基因组的rDNA区域，并且大约10个拷贝的RNA模板可以在不破坏rDNA基因的蛋白质制造活性的情况下插入。

一个巨大的核糖体生物发生中心

将转基因插入基因组的rDNA区域是有利的，除了给它们一个安全港之外。rDNA区域位于五条独立染色体的短臂上。所有这些粗短的手臂挤在一起形成一种称为核仁的结构，其中 DNA 被转录成核糖体 RNA，然后折叠成制造蛋白质的核糖体机器。在核仁内，rDNA转录受到高度调控，基因会经历快速修复，因为任何rDNA断裂，如果任其繁殖，都可能关闭蛋白质的产生。因此，任何插入基因组rDNA区域的转基因都将在核仁内用儿童手套进行处理。

“核仁是一个巨大的核糖体生物发生中心，”柯林斯说。“但它也是一个非常优越的DNA修复环境，基因插入的致癌风险很低。这些成功的复古元素——我正在将它们拟人化——已经进入了核糖体的DNA，这真是太棒了。它是多拷贝的，它是保守的，从某种意义上说，它是一个安全的港湾，你可以破坏其中一个拷贝，而细胞并不在乎。

这使得该地区成为插入人类基因治疗基因的理想场所。

柯林斯承认，关于R2如何工作还有很多未知之处，关于rDNA转录的生物学问题仍然存在：在细胞关心之前，有多少rDNA基因可以被破坏？因为有些细胞会关闭人类基因组中许多400+rDNA基因，所以这些细胞是否更容易受到PRINT的副作用？她和她的团队正在研究这些问题，同时也在调整逆转录元件插入中涉及的各种蛋白质和RNA，以使PRINT在培养的细胞和人体组织的原代细胞中更好地发挥作用。

不过，最重要的是，“它有效，”她说。“只是我们必须更多地了解我们的rDNA的生物学，才能真正利用它。

其他合著者 自然生物技术 论文是加州大学伯克利分校的研究生Connor Horton，Jeremy McIntyre，Sarah Palm和Justin Shumate。这项工作得到了美国国立卫生研究院（F32 GM139306，DP1 HL156819，T32 GM07232）和Shurl和Kay Curci基金会的支持。柯林斯已经申请了PRINT的专利，并共同创立了一家名为Addition Therapeutics的公司，以进一步开发PRINT作为基因疗法。

相关信息

• 通过仅 RNA 递送进行位点特异性安全港转基因补充 （Nature Biotechnology）
• 逆转录转座中人类 LINE-1 的模板和靶位点识别 （Nature）
• 凯瑟琳·柯林斯（Kathleen Collins）的实验室网站
• 从 DNA 到 RNA 再到 KaRNAteq （2022）
• 长期寻求的端粒酶结构为衰老、癌症药物铺平了道路（2018 年）