尽管人类微生物群落在过去几年里受到了广泛的关注，但这项研究的一个方面却很少成为头条新闻:很难观察到它是如何随着时间的推移对各种刺激做出反应的。最常见的分析方法是从粪便样本中提取细菌，然后对它们的基因组进行测序，但这种方法虽然具有最低限度的侵入性，却丢失了有关细菌在肠道中何时何地发生变化的关键信息，让科学家无法完整地了解微生物群落的动态。
现在,一项新的工具由生物工程研究所的研究人员在哈佛大学和哈佛医学院(HMS)提供了一个解决这个问题的一组的细菌基因工程检测和记录不同数量的细菌生长的变化随着时间的生活勇气的小鼠与单细胞的精度,可以作为一个平台,复杂,基于合成生物学的诊断和治疗在肠道的各种应用。发表在《自然通讯》(Nature Communications)杂志上的一项研究对该工具进行了描述。
保持时间
该系统使用一种称为阻遏器的振荡基因电路作为一种基因时钟来测量细菌的生长。阻滞剂由三种编码三种蛋白质(tetR、cl和lacI)的细菌基因组成，每一种基因都能阻止另一种蛋白质的表达。这些基因被连接成一个负反馈循环，因此当其中一种抑制蛋白的浓度低于一定水平时，它所抑制的蛋白就会被表达出来。这阻碍了第三种蛋白质的表达，并以循环的方式重复这一过程。
这张gif图显示了在菌落生长初期，当抑制因子处于其循环的不同部分时，荧光环的位置是如何变化的。资料来源:哈佛大学银实验室和威斯研究所当这三个基因全部插入质粒并导入细菌时，完成的负反馈循环的数量可以作为细菌进行了多少细胞分裂的记录。每次细菌分裂时，细胞质中出现的任何抑制蛋白都会被稀释，因此它们的浓度会逐渐下降，并在抑制周期中触发下一个蛋白的表达。至关重要的是，不管细菌的生长速度如何，抑制因子循环在15.5代细菌后重复。这使它可以作为一个客观的时间测量，很像一个时钟或手表。
“想象一下,如果你有两个人戴着两个不同的手表,和第二个手放在一个人的观察是对方的两倍,”第一作者大卫Riglar解释说,前Wyss研究所博士后和HMS现在领导一个研究小组为亨利爵士戴尔伦敦帝国理工学院的研究员。“如果你让两只手表都停了一小时，它们就不会在时间上达成一致，因为它们对时间的测量是根据秒针的移动速度而变化的。”相比之下，我们的阻遏器就像一块手表，总是以同样的速度移动，所以不管有多少人戴着它，它们都能给出一个一致的时间度量。这种特性使我们能够更精确地研究肠道细菌的行为。”
研究人员将这三种抑制蛋白分别与一种不同颜色的荧光分子结合，并开发了一种称为环状(基于抑制因子的单细胞生长推断)的成像工作流程，以跟踪在细菌生长的不同时间点上，哪种蛋白得到了表达。Riglar说:“当一个细菌群体向外生长时，抑制因子回路会产生这些不同的荧光的、类似于树环的信号，这些信号是基于抑制因子蛋白在启动该群体的单个细菌中的活性而产生的。”“荧光环的模式记录了自生长开始以来，有多少抑制因子循环，我们可以分析这种模式来研究不同细菌和不同环境下的生长速度是如何变化的。”
团队能够顺利使用戒指,追踪在几个不同种类的细菌生长在体外细胞分裂,并观察到细菌的repressilator周期的长度保持一致的生长在提取时小鼠小肠的样本(模拟复杂的微环境)或暴露于抗生素(模拟应力条件和不一致的增长模式)。
跟踪变化
为了评估抑制剂在体内的性能，研究小组将含有抑制剂回路的大肠杆菌口服给小鼠，然后分析从粪便样本中提取的细菌。该阻滞剂在被引入后的16天内仍然保持活性，这表明在活的哺乳动物的肠道细菌中可以维持长期的振荡基因表达。这些环状物分析成功地检测出了细菌生长模式的变化，通过在小鼠的饮用水中加入一种化合物，使处于不同阶段的细菌的抑制因子循环“同步”。
最后，研究人员测试了阻滞剂检测细菌生长速度差异的能力，这些差异是由肠道炎症引起的。研究人员给老鼠注射了一种炎症诱导化合物，随后又给老鼠注射了一种含有抑制素的细菌。15小时后，环分析显示，炎症小鼠体内的细菌比对照组小鼠体内的细菌有更广泛的抑制因子，这表明炎症产生的环境导致了细菌生长的不一致性，可能导致肠道菌群的不平衡。
“这repressilator真的允许我们探测生活肠道中的细菌行为的复杂性,不仅在健康和患病的州,而且时空上,“说通讯作者帕梅拉银,一个核心教员Wyss研究所和艾略特t Onie h .亚当斯HMS的生物化学和系统生物学教授。“事实上，我们可以在阻滞剂已经进入肠道的情况下重新同步它，并在不需要使用选择性抗生素的情况下维持它，这也意味着我们可以在更自然的状态下以最小的干扰来研究微生物群落。”
除了了解微生物群落的动力学，这种抑制剂还为人类肠道复杂的、基于合成生物学的诊断和治疗打开了大门。潜在的应用包括创建一个系统，该系统可以在昼夜节律的某个特定点启动基因转录级联，或记录从检测到给定的生物标志物以来经过了多长时间的诊断。
“这不仅研究解决一个具体问题相关监测动态变化生活肠道内的微生物生理学,它提供了一个平台,可能导致全新类型的诊断,甚至时间疗法,”唐纳德·因格贝尔Wyss说,世卫组织还在血管生物学教授Judah Folkman HMS和血管生物学程序在波士顿儿童医院,他也是哈佛大学工程与应用科学学院的生物工程教授。
论文的其他作者还包括来自HMS的David Richmond、Laurent Potvin-Trottier、Andrew Verdegaal、Somenath Bakshi、Emanuele Leoncini、Lorena Lyon和Johan Paulsson，以及来自Wyss Institute、HMS的Alexander Naydich和哈佛大学保尔森商学院的Alexander Naydich。
这项研究得到了人类前沿科学项目长期奖学金、门基斯基金会、惠康基金会、国家科学基金会、国防高级研究计划局、哈佛医学院和威斯生物工程研究所的支持。
新闻旨在传播有益信息，英文原版地址：https://news.harvard.edu/gazette/story/2019/10/creating-a-reliable-clock-to-track-changes-in-microbiome/